近日，华南师范大学环境学院应光国教授团队张金阁博士、史文俊副研究员等人在《Environmental Science & Technology》上发表了题为“Imidacloprid Transformation Products Exhibit Stronger Developmental Neurotoxicity than the Parent Compound in Zebrafish (Danio rerio) via the Glutamate Signaling Pathway”的研究论文。该研究多维度比较了新烟碱类杀虫剂吡虫啉（IMI）及其主要环境转化产物（TPs）对斑马鱼的发育神经毒性，发现IMI转化产物，尤其是去硝基吡虫啉（DNIMI）与吡虫啉烯烃（IMIOL）在斑马鱼早期发育阶段表现出比母体更强、更持久的发育神经毒性，并阐明了其通过干扰谷氨酸信号通路诱导神经毒性的分子机制。
图文摘要
全文速览
新烟碱类杀虫剂（NEOs）因具有良好的内吸性和高效的神经毒性，是全球使用最广泛的杀虫剂，已在各类水生生态系统中频繁检出。在前期研究中，本团队前期解析了吡虫啉（IMI）和噻虫嗪（THM）等母体化合物对斑马鱼的早期发育毒性及代际效应。然而，NEOs在环境中易发生转化，IMI作为其中的代表，在环境中可转化为多种转化产物（TPs），这些产物通常具有更强的环境持久性和迁移性，在水体中的检出浓度往往与母体相当甚至更高。尽管已知母体农药具有神经毒性，但其转化产物对非靶标水生生物的毒性效应及机制尚不清晰。本研究在前期研究的基础上，进一步将重心由母体化合物拓展至其环境转化产物。研究选取IMI及其四种转化产物（DNIMI、IMIOL、DNIMIOL与5OHIMI）为对象，多维度比较了其在斑马鱼早期发育阶段的毒性差异。实验设计分为三个阶段：Part I，在2–120 hpf窗口期评估发育毒性；Part Ⅱ，针对高毒性转化产物（DNIMI与IMIOL）开展暴露–清除实验与毒代动力学实验室，探究其体内持久性；Part Ⅲ，通过外源性谷氨酸（GLU）共暴露挽救实验，揭示了GLU信号通路在其神经毒性中的关键作用。研究结果表明，IMI的某些转化产物在环境相关浓度下对水生生物具有比母体化合物更高的生态风险。
引言
以吡虫啉（IMI）为代表的新烟碱类杀虫剂通过靶向昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）发挥杀虫作用。然而，这些农药在土壤、植物及水体中易发生生物和非生物转化，现有研究已识别出多类IMI-TPs，包括在土壤与植物体系中较为常见的5-羟基吡虫啉（5OHIMI）与吡虫啉烯烃（IMIOL），在好氧或厌氧条件下形成的去硝基吡虫啉（DNIMI），以及在紫外辐射等条件下进一步生成的去硝基吡虫啉烯烃（DNIMIOL）等。相较母体化合物，这些转化产物通常分子量更小、水溶性与迁移性更高、吸附能力更弱，因而在水体中更易迁移扩散并表现出较强的环境持久性。监测结果显示，IMI-TPs在多种水环境中具有可观的暴露水平，部分区域甚至出现转化产物浓度与IMI相当或更高的情况，这意味着水生生物可能长期处于“母体化合物—转化产物”并存的复合暴露情景中，而仅以母体化合物为目标的风险评估可能低估真实生态风险。
既往研究发现，DNIMI对神经信号传导的干扰能力以及与哺乳动物nAChR的结合亲和力显著增强；此外，5OHIMI与IMIOL在不同生物体系中显示出高于IMI的急性或慢性毒性。然而，上述认识多建立在靶标昆虫或哺乳动物模型之上，对于水生非靶标脊椎动物而言，IMI-TPs的发育神经毒性特征、暴露后效应及关键作用通路仍缺乏深入的研究。值得关注的是，既往关于NEOs的机制研究主要聚焦nAChR介导的效应，而近年来研究提示谷氨酸（glutamate，GLU）可能是NEOs暴露的敏感生物标志物之一。GLU稳态失衡及其代谢/受体功能紊乱已被证明与多类神经毒性过程相关。
基于此，为了探究新烟碱农药对GLU稳态及其相关代谢通路的影响，本研究以斑马鱼为受试生物，多层次比较IMI其主要转化产物（DNIMI、IMIOL、DNIMIOL与5OHIMI）的发育毒性与神经行为效应；结合暴露净化实验、毒代动力学实验和效应挽救实验阐述了GLU相关通路在IMI转化产物诱导斑马鱼发育神经毒性的分子作用机制，为NEOs转化产物的生态风险评估提供依据。
图文导读
1. IMI转化产物（DNIMI和IMIOL）具有更强的发育和行为毒性
为评估IMI及其主要转化产物的环境风险，通过ToxPi（毒性优先指数）模型进行毒性风险排序。ToxPi评分显示，各化合物的综合风险评分排序为：IMIOL > DNIMIOL > DNIMI > IMI > 5OHIMI。其中，IMIOL和DNIMIOL的评分显著高于母体IMI（图1A，B）。在在胚胎发育早期（24 hpf）的自发摆尾频率实验中，DNIMI和IMIOL表现出更低的半数抑制浓度（IC50），显示出更强的早期行为抑制作用（图1C）。此外，研究整合了Part I实验结果中孵化率、心率、形态发育及行为学等22项毒性终点指标进行统计分析（图1D）。主成分分析（PCA）及欧氏距离（Euclidean distance）结果显示各化合物整体发育毒性排序为：DNIMI > IMIOL > 5OHIMI > DNIMIOL > IMI（图1E，F）。基于Part I实验中DNIMI和IMIOL在低浓度下的高敏感行为抑制效应及其在综合风险评价中的突出表现，研究选取DNIMI和IMIOL作为代表性高风险转化产物，与母体化合物IMI共同进行Part II实验，以进一步探究其诱发神经行为毒性的分子机制。
Figure 1. Transformation pathways and comprehensive assessment using multi-endpoint effects and multivariate analyses of IMI and its transformation products
图1. IMI及其转化产物的转化路径及多终点效应与多变量分析的比较评估
2. 毒代动力学显示转化产物具有更强的生物持久性
为探究转化产物毒性增强的内在原因，研究通过Part Ⅱ实验深入分析了IMI、DNIMI及IMIOL在斑马鱼体内的吸收-清除动态过程（图2）。在暴露阶段（72 hpf），虽然母体IMI表现出较强的初始累积能力（BCF顺序：IMI > IMIOL > DNIMI），但在经历48 h的清除期后（120 hpf），该排序转变为DNIMI > IMIOL > IMI，DNIMI和IMIOL在体内的残留浓度显著高于母体IMI（图2D，E）。TK拟合分析显示（图2G），DNIMI和IMIOL的消除速率常数显著低于母体，表明转化产物一旦进入生物体，其降解和排出过程更为缓慢。且即使在暴露清除期也引发持续的运动减弱（Hypoactivity）效应，并且DNIMI和IMIOL组斑马鱼的心率仍未恢复至正常水平（图2H，F），表明转化产物在水生生物体内造成的长期毒性风险。
Figure 2. Toxicokinetics and assessment of physiological and behavioral responses to IMI, DNIMI, and IMIOL in zebrafish
图2. IMI、DNIMI和IMIOL在斑马鱼体内的毒代动力学特征及生理与行为响应评估
3. 谷氨酸信号通路异常是诱导神经毒性的关键标志物
为了从分子层面揭示转化产物诱导行为障碍的原因，深入分析了斑马鱼体内的神经递质稳态。实验结果显示，DNIMI和IMIOL暴露显著干扰了多种关键神经递质的平衡（图3A）。在暴露结束时（72 hpf），DNIMI和IMIOL组的GLU和γ-氨基丁酸（GABA）水平均出现剂量依赖性的显著下降。作为中枢神经系统中最主要的兴奋性递质，GLU的抑制直接削弱了神经信号的传递效率，这与观察到的斑马鱼游动能力减弱（Hypoactivity）吻合。通过多变量统计分析，研究进一步确定了这种神经化学特征的特异性。PLS-DA分析结果显示，72 hpf时，DNIMI组与对照组之间存在明显的聚类分离（R2 = 0.72，Q2 = 0.55）（图3B，C）。此外，在反映指标贡献度的VIP（Variable Importance in Projection）评分图中，GLU在所有处理组中均表现出最高的贡献得分（VIP > 1.5），因此确定GLU为关键生物标志物（图3D）。在经历48小时的净化期后（120 hpf），DNIMI和IMIOL组的GLU水平仍显著降低（图3E），说明神经递质的紊乱具有持久性。
Figure 3. Alterations in neurotransmitter profiles and screening of key neurochemical markers in zebrafish exposed to IMI, DNIMI, and IMIOL
图3. IMI、DNIMI和IMIOL暴露对斑马鱼神经递质的改变及关键神经化学标志物筛选
4. 多级分子证据揭示转化产物对谷氨酸通路的干扰机制
研究进一步观察到斑马鱼体内参与GLU合成和代谢的基因（如gad1b、glsa等）转录水平下调（图4A，B）。通过Cytoscape对蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中的高置信度节点进行可视化整合，识别出以谷氨酸脱羧酶（GAD）为核心的最大功能模块（图4D）。并且GLSA、GLSB、GLULB、GLULC、GAD1A、GAD1B及GAD2均与核心网络紧密相连，表明GLU向GABA转化是该分子网络的关键部分。分子对接结果显示，相较于母体化合物IMI，IMIOL表现出对关键蛋白更低的结合能。蛋白和酶水平分析发现，在DNIMI与IMIOL暴露组中，谷氨酰胺酶（GLS）和GAD水平显著降低，而谷氨酰胺合成酶（GLNS）水平却升高（图4C），说明既抑制了从谷氨酰胺向谷氨酸的转化，又加速了谷氨酸向谷氨酰胺的消耗。本研究中观察到的运动抑制表型，与转化产物DNIMI和IMIOL诱导的GLU显著下降相一致。综上，转化产物通过抑制关键酶活性、下调转录水平及破坏蛋白互作网络，共同构成了其诱导发育神经毒性的复杂分子机制，导致斑马鱼幼鱼显著的游泳距离和速度下降。
Figure 4. Multi-level molecular mechanisms of glutamate pathway disruption in zebrafish induced by IMI, DNIMI, and IMIOL
图4. IMI、DNIMI和IMIOL暴露诱导斑马鱼谷氨酸通路紊乱的多层级机制分析
5. 外源性谷氨酸挽救实验
为了验证谷氨酸在IMI及其转化产物诱导发育神经毒性中的作用，研究在Part Ⅲ部分设置外源性谷氨酸共暴露挽救实验（图5A），将IMI、DNIMI与IMIOL（0.05、0.5 μg/L）分别与0.5或50 μM GLU共暴露，并在72 hpf评估行为学终点及GLU通路相关分子响应。转录层面，50 μM GLU共暴露可部分缓解0.5 μg/L IMI与IMIOL造成的谷氨酸通路基因表达异常，涉及GLU代谢与转运相关基因的变化得到部分恢复（图5B）。行为上，DNIMI与IMIOL处理组中，50 μM的GLU显著缓解了斑马鱼的低活动表型（图5C）。神经化学分析结果显示，共暴露条件下多种神经递质的异常变化得到不同程度的缓解，尤其与兴奋/抑制平衡相关的递质指标呈现部分恢复（图5D）。蛋白水平上，GLNS、GLS、GAD的相对水平在共暴露后出现化合物与剂量依赖的改变（图5E）。外源性谷氨酸共暴露恢复实验在行为、神经递质与分子层面提供一致证据，表明GLU通路受损与转化产物增强的发育神经毒性密切相关。
Figure 5. Rescue effects of exogenous glutamate on developmental neurotoxicity induced by IMI, DNIMI, and IMIOL and mechanistic validation
图5. 外源性谷氨酸对IMI、DNIMI和IMIOL诱导的发育神经毒性的挽救效应及机制验证
结论与意义
团队前期研究显示环境相关浓度下新烟碱类杀虫剂吡虫啉和噻虫嗪会显著影响斑马鱼幼鱼的神经发育，且吡虫啉和噻虫嗪具有雌激素效应，即使单亲暴露也会引起代际效应，导致F1代斑马鱼产生内分泌干扰效应及发育毒性。前期研究仅关注了母体化合物的毒性效应，而忽视了环境中广泛存在的转化产物对鱼类的影响。本研究发现IMI转化产物DNIMI和IMIOL在发育神经毒性上强于母体IMI，阐明了其通过干扰谷氨酸通路导致斑马鱼发育神经毒性的分子机制，表明对非靶标生物（如鱼类）也构成潜在的生态风险。这一发现强调了在评估农药环境安全性时，不仅要关注母体化合物，还应重视具有持久性、流动性、更高毒性特征的转化产物对水生生态系统的潜在威胁。该研究有助于更完整地认识IMI及其转化产物对水生生物的危害，为科学防控新烟碱类杀虫剂污染提供参考依据。
全文链接
Zhang, J.-G.; Shi, W.-J.; Cao, Z.; Lu, Z.-J.; Xin, N.; Ma, D.; Meng, Y.-Z.; Zhang, Q.-Q.; Ying, G.-G. Imidacloprid Transformation Products Exhibit Stronger Developmental Neurotoxicity than the Parent Compound in Zebrafish (Danio rerio) via the Glutamate Signaling Pathway. Environ. Sci. Technol. 2026, 60 (8), 6122-6136.
Zhang, J.G.; Shi, W.; Ma, D.-D.; Lu, Z.-J.; Li, S.-Y.; Long, X.-B.; Ying, G.-G. Chronic Paternal/Maternal Exposure to Environmental Concentrations of Imidacloprid and Thiamethoxam Causes Intergenerational Toxicity in Zebrafish Offspring. Environ. Sci. Technol. 2023, 57 (36), 13384–13396.
Zhang, J. G.; Ma, D. D.; Xiong, Q.; Qiu, S. Q.; Huang, G. Y.; Shi, W. J.; Ying, G. G. Imidacloprid and Thiamethoxam Affect Synaptic Transmission in Zebrafish. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2021, 227, 112917.